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产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）的威胁：STEC是导致严重食源性感染的主要病原体之一，其常见的血清型包括大肠杆菌O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。这些菌株可引发一系列严重症状，如腹泻、出血性结肠炎，甚至溶血性尿毒症综合征（HUS），后者可能导致肾功能衰竭和神经系统并发症，对公共健康构成重大威胁。
疫苗现状的挑战：目前，尚无许可的疫苗能够提供针对多种STEC感染的有效保护。已开发的疫苗，如Epitopix SRP和Econiche，主要针对牛O157大肠杆菌感染，且缺乏对非O157血清型的交叉保护，这限制了其在更广泛范围内的应用。
外膜囊泡（OMV）的潜力：OMV是革兰氏阴性细菌外膜释放的球形纳米级结构，含有多种免疫原性抗原，如脂多糖（LPS）、脂蛋白和肽聚糖。由于其天然的免疫原性和良好的生物相容性，OMV被视为下一代疫苗的理想载体。
本研究旨在构建工程改造的鼠伤寒沙门氏菌，快速产生低内毒素活性的外膜囊泡（OMV），用于递送大肠杆菌的 O 抗原。同时评估展示混合 O 抗原的 OMV 的免疫原性，以及其对抗多种野生型 STEC 感染小鼠的能力，为开发新型、广谱的 STEC 疫苗提供实验依据。
研究人员使用等位基因交换方法，依次在SW121（ΔrfbPΔfliCΔfljB）基因组中引入ΔpagP81、ΔpagP81::PlpplpxE、ΔtolR和Δasd突变，生成工程化鼠伤寒沙门氏菌菌株。同时，构建了携带大肠杆菌O111、O157、O26、O45、O145和O103 O抗原生物合成基因的质粒，并导入到工程化鼠伤寒沙门氏菌中，以实现O抗原的表达。
图1. 鼠伤寒沙门氏菌衍生的OMV显示混合异源O抗原示意图
OMV的生产和纯化
工程化沙门氏菌在LB培养基中培养，通过超速离心和密度梯度离心等方法分离和纯化OMV，以获得高纯度的OMV样品。
免疫接种：小鼠通过腹腔注射接受含1µg OMV的PBS溶液，作为阴性对照组则给予不含载体的沙门氏菌衍生的OMV。
免疫原性评估：在初次免疫后第14天、第35天、第49天和/或第120天采集血样，通过ELISA测定血清中大肠杆菌LPS特异性IgG和IgA抗体的浓度，以评估OMV的免疫原性。
生存试验：在初次免疫后第8周，通过腹腔注射挑战评估免疫小鼠的保护率，以验证OMV疫苗的保护效果。
粪便细菌负荷：研究口服途径感染大肠杆菌后，免疫小鼠粪便中野生型大肠杆菌O111和O157的水平，以进一步评估疫苗的保护作用。
流式细胞术应用
补体沉积试验：初次接种后第 49 天采集同一组雌性小鼠血清样本，混合并在 56°C 下灭活 30 分钟。将野生型大肠杆菌 O111 或 O157 菌株与热灭活混合血清混合，孵育后用 PBS 洗涤，再暴露于含有幼兔补体的 PBS 溶液中孵育。处理过的细菌用 FITC 偶联的山羊抗兔补体多克隆抗体处理，最后使用流式细胞仪检测分析 C3 补体沉积情况，评估抗体介导的补体激活能力。
工程化OMV疫苗能产生功能性血清抗体：通过层浪流式细胞仪（FongCyte™)检测FITC荧光信号，发现实验组接种工程化OMV疫苗的小鼠混合血清在相应的E. coli菌株上介导了相似水平的C3沉积（ 图2A和B），这表明免疫小鼠产生的抗体能够有效地识别并结合到细菌表面，进而激活补体系统。
载体安全性验证：相反，OMV载体组未检测到细菌上的C3沉积（图2A和B）。这说明OMV载体本身不会引发非特异性的补体激活，从而验证了疫苗载体的安全性。
图2 血清抗体体外生物功能检测
层浪流式细胞仪FongCyte™
意义
这些结果表明，工程化鼠伤寒沙门氏菌 OMV 诱导的针对大肠杆菌 O111 和 / 或 O157 O 抗原的特异性血清抗体具有显著生物学功能。它们不仅能特异性结合到细菌表面，还能有效介导补体沉积，这是宿主免疫系统抵御病原体和调节免疫反应的重要过程。此外，流式细胞术结果支持了 OMV 作为疫苗载体的潜力。由于 OMV 能诱导产生具有补体沉积能力的功能性抗体，有望成为开发新型、广谱疫苗的有效工具。
疫苗开发的新策略：本研究开发的STmOMV能够展示混合异源O抗原，为预防多种STEC感染提供了一种创新且改进的策略。与传统的单一抗原疫苗相比，这种混合O抗原的OMV疫苗具有更广谱的保护作用。
免疫原性评估的新方法：传统的疫苗评估方法多聚焦于抗体水平的检测，而本研究则通过流式细胞术等技术手段，进一步评估了抗体的功能活性，为疫苗研发提供了更全面的评估指标。
多价疫苗的潜力：研究显示，三种混合的 STmOMV 经腹腔注射小鼠后，可对六种大肠杆菌感染产生有效保护，表明 OMV 中混合多糖或为多价疫苗，能覆盖常见大肠杆菌血清型，该开发策略既扩大疫苗保护范围，又有助于减少接种次数与成本，具重要公共卫生意义。
安全性与免疫原性的平衡：OMV 作为疫苗载体实现二者有效平衡，本研究表明其本身不引发非特异性免疫反应或毒性作用，保障安全性，同时能有效递送抗原并诱导强烈免疫反应，确保免疫原性，为未来疫苗开发提供新思路
参考文献：
Bian, X., Chen, Y., Zhang, W. et al. Salmonella Typhimurium derived OMV nanoparticle displaying mixed heterologous O-antigens confers immunogenicity and protection against STEC infections in mice. Microb Cell Fact 24, 8 (2025). https://doi.org/10.1186/s12934-024-02640-6
