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Ⅰ：跟着步骤走，小鼠脾脏组织单细胞悬液制备so easy！
Ⅱ：一学就会！小鼠淋巴结&胸腺单细胞悬液制备全流程
口腔黏膜是机体重要屏障，由层状上皮覆盖，抵御病原体入侵、保护内部组织。按解剖和结构可分为内衬、咀嚼和特化黏膜，其中颊部属内衬黏膜。黏膜中复杂的免疫网络既调控抗原反应，又维持耐受，一旦失衡可引发牙周炎。
在本期推文中，我们将为您详述小鼠口腔组织单细胞悬液的制备及流式分析流程。
37 °C快速解冻→56 °C水浴灭活60 min→分装→ –20 °C冷冻保存
500 mL PBS（磷酸盐缓冲液） + 2% （v/v）FCS，充分混匀
每个样品各1mL消化混合物
FACS缓冲液中：胶原酶 Ⅱ （终浓度为2 mg/mL） + DNase I （终浓度为1 mg/mL）
每个样品各1mL Dispase Ⅱ溶液
FACS缓冲液中：Dispase Ⅱ（终浓度达到2 mg/mL）
图1
图2
1.下颌骨分离：
处死小鼠后，自下门牙之间用组织剪刀切开，取下颌骨两侧（图2A）并用针固定（图1）。
2.处理舌头和颊粘膜：
· 切断舌头（图1蓝色处），并去除肌肉，放置在1mL预冷FACS缓冲液的24控板中；
· 细剪刀剪取颊黏膜两侧（图1红色处），同样置于含有1mL预冷FACS缓冲液的24孔板中。
3.其他口腔组织取样：
· 去除上门牙后面软硬组织（图2B）第三磨牙后软硬组织做切口（图2C）；
· 拉下下颌骨，进入鼻腔，与上腭平行切割组织（图2D）；
· 另一侧重复该操作，切下腭骨、上颌骨与中间的腭部（图2E），分离牙龈组织（图2F）。
4.分离上腭组织与NALT：
精确去除牙龈上腭组织和NALT（鼻相关淋巴组织）后，放置在1 mL FACS缓冲液的冰上24孔板中
1. 将组织置1.5 mL EP管，加入200 μL消化混合物；
2. 细剪至微碎，每次操作后清洁剪刀防止交叉污染；
3. 每个样品再加入800 μL消化混合物，37 °C恒温振荡（1200 rpm）20 min；
4. 继续加20 μL 0.5 M EDTA（终浓度为10 mM），37 °C恒温摇床上再孵育10 min；
5. 上下移液样品数次，使其70 μm滤器进入50 mL管收集细胞，先用1 mL缓冲液清洗1.5 mL EP管，涡旋后倒入细胞过滤器，使用10 mL缓冲液冲滤过滤器；
6. 过滤后的样品在4 °C以下、350 × g条件下离心5 min，弃上清，在500 μL缓冲液中重悬，进行细胞计数后冰上保存 。
在处理上颌骨牙龈组织时，要小心精确地清除NALT，因其富含白细胞，若残留易造成样本污染。
在消化混合物中直接切割组织，可有效避免切割后转移细胞过程中的细胞丢失。
组织消化后，可在FACS缓冲液中添加2 mM的EDTA，以防止细胞聚集，避免堵塞FACS仪器。
如需分开分析上皮细胞和固有层，可在胶原酶/DNAse消化前进行分离。分离后，将组织分别在37°C的Dispase II溶液中孵育，牙龈组织孵育35分钟，颊黏膜孵育60分钟，舌组织孵育70分钟。
通过特定的圈门策略对细胞进行分类分析，圈门过程基于细胞的多种特性和标记物表达情况分析口腔黏膜组织中的树突状细胞（DC）和朗格汉斯细胞（LC）亚群。
(A) 从左至右依次为
1. 排除碎片：FSC-A/SSC-A；
2. 圈出单个细胞：FSC-A/FSC-H；
3. 排除死亡细胞：活性染料阴性群体；
(B) 界定中性粒细胞：CD45+Ly6G+；
(C) 细分MHC-II+细胞：
1.抗原呈递细胞（APC）：MHC-II+CD11c-；
2.树突状细胞（DC）：MHC-II+CD11c+；
(C) 识别巨噬细胞：MHC-II+CD11b+ （可加CD11b和F4/80进一步确认）；
(D) 区分LC和间质DC：
1.朗格汉斯细胞（LC）：EpCam+Langerin+；
2.间质DC：EpCam−Langerin-；
(E) 细分LC亚群：
1.CD11b+ LC：CD11b+CD64-；
2.moLC：CD64+CD11b+；
(F) 3.CD103+ LC：CD11b-CD64-；
4.CD103+ LC：CD103呈阳性表白；
(F) 区分间质DC亚群：
1.cDC1：Sirpα-XCR1+，CD11-；
2.cDC2：Sirpα+XCR1neg，多数表达CD11b。
抗体浓度需根据流式细胞仪及其激光进行调整。
不同口腔黏膜组织中树突状细胞（DC）亚群的分布存在差异，这是因为每种组织都有其独特的白细胞组成。为避免细胞结合的Fcγ受体对染色抗体的非特异性识别，可使用市售的纯化大鼠抗小鼠抗CD16/32抗体，以阻断Fcγ RIIB/III受体。
与皮肤不同，在口腔组织中，CD24与Langerin不存在相关性，因此不能用CD24替代Langerin来避免细胞内染色。
若要分析朗格汉斯细胞（LC）等稀有细胞类型的亚群，建议每个样本汇集3-5只小鼠的口腔组织，以确保流式细胞术（FACS）分析结果准确可靠。
为避免在样本采集过程中细胞丢失，在采集前可增加用于重悬细胞的FACS缓冲液的体积。
首次进行抗体染色混合时，建议使用专用的Brilliant Stain Buffer，以消除基于聚合物的荧光染料之间的非特异性反应，因为这种反应可能导致数据补偿不足。
参考文献
Probst, Hans 等. (2022). Guidelines for DC preparation and flow cytometry analysis of mouse nonlymphoid tissues. European Journal of Immunology. 53. n/a-n/a. 10.1002/eji.202249819.
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