应用精要 | OMIP-100：14色方案分析人中性粒细胞亚群-应用案例-北京层浪生物科技有限公司

应用精要 | OMIP-100：14色方案分析人中性粒细胞亚群

实验背景

中性粒细胞是先天免疫的核心效应细胞，通过吞噬作用、活性氧释放及胞外陷阱（NETs）形成清除病原体。新研究突破传统中性粒细胞寿命短暂的观点，揭示其具有长期存活能力、转录可塑性及免疫调节功能，并在脓毒症、癌症等疾病中呈现特异性活化标志物。然而，系统性检测方法的缺乏限制了中性粒细胞亚群的功能解析及临床应用。为此，本研究设计了一款14色多色流式检测体系（OMIP-100），整合13种抗体，覆盖细胞发生（如Olfactomedin 4）、成熟/活化（CD10）、迁移及免疫调节相关标志物（CD177等），通过优化荧光团分配（FITC/AF488、PE、APC）实现核心亚群稳定鉴定的同时保留标志物可替换性，支持新抗原或功能底物的灵活拓展。该方案适用于全血、唾液及体外迁移模型等多种样本类型，动态评估健康与疾病状态下中性粒细胞的可塑性，为解析其病理生理机制及临床转化提供标准化技术平台。

流式方案

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实验样本：

人外周血体外纯化血中性粒细胞

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检测指标及荧光素：

Antigen	Fluorochrome	Clone	Purpose
CD16	BUV395	3G8	Phagocytosis capacity,GRIM,immunosuppressive
CD54	BUV496	HA58	Reverse transmigration
CD11b	BUV737	ICRF44	Migration
CD184	BV421	12G5	Ontogeny
CD49d	BV480	9F10	Immune modulation
CD63	BV650	H5C6	Primary granule release,GRIM subset
CD15	BV786	W6D3	Lineage
OLFM-4	AF488	12	Peripheral blood subset
CD10	PE	HI10a	Ontogeny
CD66b	PE/Fire	640	6/40c Lineage,secondary granule release
CD62L	PE/Cy7	DREG-56	Migration,immune modulation
CD177	APC	MEM-166	Peripheral blood subset
CD45	R718	HI30	Lineage
Live/dead	FVS780	-	Live/dead discrimination

流式实验结果

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健康成人全血的门控策略示例：

首先，使用 Time 和 SSC-A 进行初步门控，以排除时间不一致的数据。接着，利用 FSC-A 和 SSC-A 门控排除碎片和噪音信号，然后通过 FSC-H 和 FSC-A 选择单细胞事件，确保分析的对象是单个细胞。

接下来，通过 CD45+R718 和 FVS780 筛选出活跃的白细胞，最后使用 CD15hi BV786 和 CD66bhi PE/Fire 640 精确筛选出纯中性粒细胞。在获得纯中性粒细胞群体后，可以进一步分析其下游种群，包括：血液亚群、迁移能力、颗粒释放、免疫调节、罕见亚群、颗粒释放免疫调节、代谢增强（GRIM）和细胞成熟。

数据分析方法

为了深入探究中性粒细胞表型的个体差异和细微特征，研究采集了多种样本中的中性粒细胞群体。将每个样本的细胞数量降采样至10000个粒子数，并运用Specter R包进行UMAP分析（参考图2）。这种分析方法可以将高维的单细胞数据映射到低维空间，从而直观展示不同样本来源中性粒细胞的分布情况和特征差异。

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图2

样本来源包括供体的全血、经迁移刺激但未感染的中性粒细胞、受铜绿假单胞菌感染且经迁移刺激的中性粒细胞以及健康人的唾液（参考图3）

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图3

UMAP簇根据样本来源进行颜色区分，紫色代表全血，蓝绿色代表未感染但有迁移刺激的中性粒细胞，红色代表受铜绿假单胞菌感染且有迁移刺激的中性粒细胞，绿色代表健康人的唾液。

图4展示了每个标记物相对表达量的热图和树状图，通过热图可以清晰地看到不同亚群中各标记物的表达水平差异，树状图则有助于分析不同亚群之间的亲缘关系和相似性。

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图4

总结

本研究成功构建了一套适用于临床及实验室样本的人类中性粒细胞深度表型分析技术平台。该方案不仅实现了对中性粒细胞亚群发生、迁移及免疫调节功能的精细化解析，创新性地提出在外周血单个核细胞（PBMC）分离与低温保存前完成中性粒细胞表型检测的策略，有效规避了中性粒细胞因低温敏感性导致的活性损失问题，显著提升了血液样本分析的可靠性。

基于标准化多色流式检测体系（OMIP-100）的灵活设计，该平台可适配全血、唾液及体外迁移模型等多种样本类型，其标志物可替换性设计为探索新型抗原或功能底物提供了拓展空间。研究团队预期，该技术的广泛应用将突破现有中性粒细胞研究的检测瓶颈，推动其在感染、脓毒症及肿瘤微环境等疾病动态监测中的转化应用。未来研究可基于此技术框架，深度解析疾病特异性中性粒细胞亚群的分子特征与功能调控网络，为靶向治疗策略的开发提供全新视角。

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