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肺部是机体与外界环境接触最为频繁的器官之一，每一次呼吸都可能遭遇病原体、过敏原和污染物等潜在威胁。为了应对这些挑战，肺部建立了一个高密度的抗原呈递细胞（APC）网络，其中包含专业的树突状细胞（DC）和特定的巨噬细胞子集。这些细胞宛如忠诚的哨兵，不仅承担警戒职责，更能够对侵入的病原体及其他免疫威胁发起有效的免疫应答。由此可见，肺部在机体免疫系统中具有举足轻重的地位，是深入探索免疫功能与机制的重要窗口。
在本篇推文中，我们将介绍一套制备小鼠肺组织单细胞悬液的详细方法，并通过流式细胞术对肺部的树突状细胞和巨噬细胞进行检测和分析。
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使用无菌溶液和无菌操作，将脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）溶解在PBS中，使终浓度为500 U/mL。
胶原酶IV（Collagenase IV）：
使用无菌溶液和无菌操作，将胶原酶IV溶解在PBS中，使其浓度达到10,000 U/mL。
在水浴中以37°C解冻FCS，一旦完全解冻，在56°C的水浴中孵育30 min。通过无菌0.45μm过滤器直接过滤温热的FCS，并制备等分试样。将热灭活FCS储存在-20°C下，避免重复冻融循环。在整个过程中使用无菌操作。
流式缓冲液（FACS Buffer）：
在500 mL PBS中加入2%的FCS（v/v）和22 mM EDTA。
消化液：
每只小鼠，在RPMI培养基中制备2 mL由200 U/mL胶原酶IV和0.5 U/mL DNAse I组成的消化液。
将186.2gEDTA（乙二胺四乙酸二水二钠盐）溶解在800 mL水中，加入20 g氢氧化钠微球。将pH调整到8，并将水添加到1000 mL。在室温下保存，使用前记得将缓冲液稀释至1倍浓度。
小鼠肺组织单细胞悬液的逐步制备
1.处死小鼠，用爪子把动物固定在垫子上。向动物喷洒70%的乙醇；
2.切开腹部以上的皮肤，进一步向下巴开放，暴露腹腔；
3.用一把钝尖剪刀切开肋骨，打开腹腔；把肋骨拔掉；
4.对肺进行解剖。右肺由四个叶组成，而左肺只有一个叶；
5.小心地切断气管，去除任何附着在肺上的脂肪；
6.将肺取入含有300 μl消化溶液的2 mL离心管中；
7.用剪刀把肺压在管子里切成小块；
8.加入700 μl的消化液；
9.样品在800 rpm下，37℃孵育30 min；
10.从摇床上取出试管，再加1 mL消化液；快速涡旋样品；
11.将样品以800 rpm在37°C下孵育30 min；
12.从摇床上取出管子，放在冰上敷2 min；
13.加入40 μl 500 mM EDTA，冰下孵育2 min；
14.用1 mL FACS缓冲液在50 mL管上制备70 μm细胞过滤器；
15.将肺细胞悬液倒入细胞过滤器上；
16.加入9 mL的FACS缓冲液，从过滤器中清洗剩余的细胞；
17.380×g离心7 min；
18.将细胞重悬1×ACK裂解缓冲液中，室温孵育2 min；
19.加入过量的FACS缓冲液，停止裂解；
20.380×g离心7 min;
21.在2 mL FACS缓冲液中重悬浮细胞。用70 μm的细胞过滤器细胞悬液，去除团块；
22.计数，准备制备染色样本
通过酶消化8周龄C57BL/6小鼠肺制备单细胞悬浮液，然后用一组15种表面标记物染色。记录3×106个事件，用于随后鉴定肺髓系来源细胞。排除碎片和粘连体后，通过CD45的表达来鉴定免疫细胞。排除谱系阳性淋巴细胞（B220+、CD19+、Nk-1.1+、NKP46+、Ter-119+、TCR-β+）和死细胞（APC-Cy7中的DRAQ7+）。根据其表面标记物表达模式，鉴定了小鼠肺中存在的所有髓系来源细胞。
图1流式圈门
图2流式分析的画门策略
圈门逻辑：
A.细胞根据其大小（FSC-A/SSC-A）进行圈门，以排除碎片；
B.通过FSC-A/FSC-W和SSC-A/SSC-W排除粘连体，圈出单个细胞；
C.圈出CD45+总免疫细胞；
D.在CD45+门中，圈出Lin+DRAQ7-细胞群；
E.在Lin+DRAQ7-细胞群中，通过Ly6G+圈出中性粒细胞；
F.Ly6G-群体中，界定CD64+MerTK+的巨噬细胞，并在巨噬细胞中通过CD11b和SigleF鉴定肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞；
G.在CD64-MerTK-群中，通过CD11c和MHC-II圈门：
1.CD11c-MHC-II-门中，进一步圈出CD11b+细胞群，在CD11b+圈中，SigleF+群体为嗜酸性粒细胞；
2.SigleF-群体中，再通过CD43-Ly6c+鉴定Ly6c高表达单核细胞，CD43+Ly6c-鉴定Ly6c低表达单核细胞；
3.CD11c+MHC-II+门中,圈出CD64-CD26+细胞群；
4.在此门下，通过CD172α+XCR1+鉴定cDC1；CD172α+XCR1-鉴定cDC2
5.cDC2可进一步用过CD11b和CD301b区分为：CD301b+cDC2和CD301b-cDC2
参考文献：Probst, Hans Christian et al. “Guidelines for DC preparation and flow cytometry analysis of mouse nonlymphoid tissues.” European journal of immunology, 10.1002/eji.202249819. 13 Dec. 2022, doi:10.1002/eji.202249819
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