层浪流式笔记——细胞周期②-应用案例-北京层浪生物科技有限公司

层浪流式笔记——细胞周期②

层浪流式笔记的开篇，由《细胞周期的制备和检测》拉开序幕。不忘初心，方得始终。栏目全新启航，我们选择依然续写流式与细胞周期的故事。本期为大家带来的是：细胞周期的数据质量评估和常见应用场景。

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周期数据质量评估

工欲善其事，必先利其器。漂亮的细胞周期数据离不开性能优异的仪器，因此，首先需要通过《中华人民共和国医药行业标准YY/T 0588-2017》^[1]来评估流式细胞仪的性能。本文中使用BD的DNA质量控制试剂盒，对层浪流式细胞仪检测到的DNA数据进行质量评估。

DNA质量控制试剂盒内容：

🔶 小鸡红细胞核（CEN）：用于建立测试条件。

CEN试剂经过特殊处理，内含单个核、双联体核、三联体核和更大的聚集体，用来检测仪器的线性度和分辨率。经PI染色后，由于细胞核聚集程度的不同，在PI的直方图中会出现至少4个峰，前4个峰分别代表单个核、双联体核、三联体核和四联体核。若染色正常，仪器线性度良好，则四个峰所在道数的平均比值接近1:2:3:4。

🔶 小牛胸腺细胞核（CTN）：具有一个完整的细胞周期，且具有细胞周期的各个时期，大部分核处于G0/G1期，小部分处于S期和G2/M期。还可作为细胞周期统计分析的质控。

🔶 2μm的荧光微球：作为一种稳定的非生物标准品来确认仪器的CV（细胞离散度），要求仪器CV＜2.3%。

🔶 核酸染料碘化丙啶（PI）

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图1：DNA QC试剂盒数据

数据评估结果：

出现明显7峰，且检测CEN结果为（图1A）PK1:PK2:PK3:PK4:PK5:PK6:PK7 = 1.00:2.00:2.99:3.97:4.94:5.93:6.87 (≈1:2:3:4:5:6:7)。

【行业要求CEN结果满足至少出现4个峰，且前四个峰的比值接近1:2:3:4】

CTN检测结果为周期拟合G2/G1=2.01（图1B）。

【行业要求G2/M与G0/G1的平均荧光强度比值在1.95-2.05之间】

2μm微球结果CV=1.75%（图1C）。

【行业要求CV＜2.3%】

综上可得，层浪流式细胞仪在DNA检测中表现良好，QC数据均远超行业标准，满足临床/科研实验需求，是流式分析细胞周期的卓越选择。

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细胞周期应用场景

1、细胞系

细胞系是周期实验研究常用的样本，如图2分别依次为A图：MCF-7乳腺癌细胞系、B图：MDA-MB-231乳腺癌细胞系、C图：HL-7702[L-02;LO2]肝细胞系。不同细胞系周期检测及拟合结果如下图所示：

图片2.png

图2：常见细胞系自动周期拟合

数据分析与解读

三种细胞系检测到的CVG1值分别为：MCF7-1.63%、231-2.09%、LO2-2.93%。

【正常二倍体的CVG1应＜8%】

注

G0/G1峰的CV（CVG1）显著影响S期计算的准确性，然而在实际应用中，由于肿瘤样本会存在多个亚群，其CVG1值可能会偏高，影响结果。建议将CVG1＜8%的肿瘤样本用于有用的S期测定。

检测到的RCS（限制性立方样条回归，用来反映样本的拟合程度）分别为：3.55、2.78、3.70。

【RCS＜3.0，表示拟合良好；RCS在3.0-5.0，被认为是基本拟合；RCS＞5.0，表明拟合匹配度差】

2、生殖细胞

在生殖相关研究中，生殖细胞不同时期百分比的变化一直是研究的重点。以C57BL/6小鼠精囊为例，可以检测到不同时期的细胞数量百分比：亚倍体（sub1N）细长精子细胞；单倍体（1N）圆形精子细胞；二倍体（2N）精原细胞；四倍体（4N）精原细胞G2M期。使用层浪流式细胞仪PI检测精细胞周期结果如图3所示：

图片3.png

图3：C57BL/6小鼠精囊周期检测

数据分析与解读

亚倍体（sub1N）和单倍体（1N）百分比为64.66%、二倍体（2N）百分比为7.52%、四倍体（4N）的百分比为20.84%，与文献报道中正常C57BL/6生殖细胞占比一致。^[2]

3、植物细胞

植物细胞的多倍化对于研究个体生长发育具有重要的生物学意义。流式细胞仪检测植物倍体具有简单、快速、准确、直观等优点，在植物学中有着越来越广泛的应用价值。模式生物拟南芥是植物倍体研究的经典角色，用层浪流式细胞仪对其叶片倍体进行检测和分析，得到图4结果：

图片4.png

图4：拟南芥叶片周期检测

数据分析与解读

PK1:PK2=1:1.9，接近1:2。

注

植物周期检测一般不用周期拟合软件拟合，根据标准品确定样本有单倍体、二倍体、四倍体，或者多倍体。植物可以检测的样本有：根、茎、叶、种子、花等。

总结

层浪流式细胞仪对DNA QC试剂盒（CEN/CTN/微球）的各项检测结果均表现优异，表明仪器的性能不仅满足各类样本细胞周期检测的需求，其检测结果更是远优于行业检测标准的要求，特别是CEN检测，可以检测出多个峰值，且符合倍比关系。

除此之外，层浪流式细胞仪分析软件ModelFlower内置细胞周期分析功能，可以对周期数据进行一键拟合，并有批量分析与批量数据导出的功能。

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注意事项

周期数据对于细胞收集量有什么要求？

除去碎片之外，建议可供分析的目的细胞在1万以上，虽然细胞数据过大会影响到分析的速度，但不会对细胞各个时期的百分比检测产生影响，拟合效果反而更好，因此在条件允许的情况下，收集量多多益善。

周期拟合不准确可以自行调整吗？

可以的。且自动拟合之后如不满意结果，也可以通过手动调整的方式，改变G1和G2门的位置，还可以批量应用到其他样本中以保持一致性。

周期检测可能会受到哪些因素的影响？

首先，不同细胞系的拟合效果存在差异。其次，影响周期拟合效果的因素还有：试剂盒差异、细胞固定方式的影响、收集细胞量的差异、人为操作影响等。因此，为了尽量减少差异，操作标准要规范，最大程度上避免操作误差。

参考文献

[1]中华人民共和国医药行业标准YY/T 0588-2017,流式细胞仪.国家食品药品监督管理局.2017.

[2]R.B. Struijk,1 C.M. De Winter-Korver,1 S, Simultaneous Purifification of Round and Elongated Spermatids from Testis Tissue Using a FACS-Based DNA Ploidy Assay，International Society for Advancement of Cytometry.

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