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层浪流式笔记——细胞周期②



层浪流式笔记的开篇,由《细胞周期的制备和检测》拉开序幕。不忘初心,方得始终。栏目全新启航,我们选择依然续写流式与细胞周期的故事。本期为大家带来的是:细胞周期的数据质量评估和常见应用场景


流式笔记
周期数据质量评估


工欲善其事,必先利其器。漂亮的细胞周期数据离不开性能优异的仪器,因此,首先需要通过《中华人民共和国医药行业标准YY/T 0588-2017》[1]来评估流式细胞仪的性能。本文中使用BD的DNA质量控制试剂盒,对层浪流式细胞仪检测到的DNA数据进行质量评估。


DNA质量控制试剂盒内容:


🔶 小鸡红细胞核(CEN):用于建立测试条件。

CEN试剂经过特殊处理,内含单个核、双联体核、三联体核和更大的聚集体,用来检测仪器的线性度和分辨率。经PI染色后,由于细胞核聚集程度的不同,在PI的直方图中会出现至少4个峰,前4个峰分别代表单个核、双联体核、三联体核和四联体核。若染色正常,仪器线性度良好,则四个峰所在道数的平均比值接近1:2:3:4。

🔶 小牛胸腺细胞核(CTN):具有一个完整的细胞周期,且具有细胞周期的各个时期,大部分核处于G0/G1期,小部分处于S期和G2/M期。还可作为细胞周期统计分析的质控。

🔶 2μm的荧光微球作为一种稳定的非生物标准品来确认仪器的CV(细胞离散度),要求仪器CV<2.3%。

🔶核酸染料碘化丙啶(PI)


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图1:DNA QC试剂盒数据


数据评估结果:

01

出现明显7峰,且检测CEN结果为(图1A)PK1:PK2:PK3:PK4:PK5:PK6:PK7 = 1.00:2.00:2.99:3.97:4.94:5.93:6.87 (≈1:2:3:4:5:6:7)。

【行业要求CEN结果满足至少出现4个峰,且前四个峰的比值接近1:2:3:4】

02

CTN检测结果为周期拟合G2/G1=2.01(图1B)。

【行业要求G2/M与G0/G1的平均荧光强度比值在1.95-2.05之间】

03

2μm微球结果CV=1.75%(图1C)。

【行业要求CV<2.3%】

综上可得,层浪流式细胞仪在DNA检测中表现良好,QC数据均远超行业标准,满足临床/科研实验需求,是流式分析细胞周期的卓越选择。


流式笔记

细胞周期应用场景
1、细胞系

细胞系是周期实验研究常用的样本,如图2分别依次为A图:MCF-7乳腺癌细胞系B图:MDA-MB-231乳腺癌细胞系C图:HL-7702[L-02;LO2]肝细胞系。不同细胞系周期检测及拟合结果如下图所示:

图片2.png

图2:常见细胞系自动周期拟合

数据分析与解读

1

三种细胞系检测到的CVG1值分别为:

MCF7-1.63%、231-2.09%、LO2-2.93%

【正常二倍体的CVG1应<8%】

G0/G1峰的CV(CVG1)显著影响S期计算的准确性,然而在实际应用中,由于肿瘤样本会存在多个亚群,其CVG1值可能会偏高,影响结果。建议将CVG1<8%的肿瘤样本用于有用的S期测定。

2

检测到的RCS(限制性立方样条回归,用来反映样本的拟合程度)分别为:3.552.783.70

【RCS<3.0,表示拟合良好;RCS在3.0-5.0,被认为是基本拟合;RCS>5.0,表明拟合匹配度差】

2、生殖细胞

在生殖相关研究中,生殖细胞不同时期百分比的变化一直是研究的重点。以C57BL/6小鼠精囊为例,可以检测到不同时期的细胞数量百分比:亚倍体(sub1N)细长精子细胞;单倍体(1N)圆形精子细胞;二倍体(2N)精原细胞;四倍体(4N)精原细胞G2M期。使用层浪流式细胞仪PI检测精细胞周期结果如图3所示:

图片3.png

图3:C57BL/6小鼠精囊周期检测

数据分析与解读

亚倍体(sub1N)和单倍体(1N)百分比为64.66%、二倍体(2N)百分比为7.52%、四倍体(4N)的百分比为20.84%,与文献报道中正常C57BL/6生殖细胞占比一致。[2]


3、植物细胞

植物细胞的多倍化对于研究个体生长发育具有重要的生物学意义。流式细胞仪检测植物倍体具有简单、快速、准确、直观等优点,在植物学中有着越来越广泛的应用价值。模式生物拟南芥是植物倍体研究的经典角色,用层浪流式细胞仪对其叶片倍体进行检测和分析,得到图4结果:

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图4:拟南芥叶片周期检测

数据分析与解读
1

PK1:PK2=1:1.9,接近1:2。

植物周期检测一般不用周期拟合软件拟合,根据标准品确定样本有单倍体、二倍体、四倍体,或者多倍体。植物可以检测的样本有:根、茎、叶、种子、花等。


 总结

一键拟合功能示意

层浪流式细胞仪对DNA QC试剂盒(CEN/CTN/微球)的各项检测结果均表现优异,表明仪器的性能不仅满足各类样本细胞周期检测的需求,其检测结果更是远优于行业检测标准的要求,特别是CEN检测,可以检测出多个峰值,且符合倍比关系。

除此之外,层浪流式细胞仪分析软件ModelFlower内置细胞周期分析功能,可以对周期数据进行一键拟合,并有批量分析批量数据导出的功能。



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注意事项


Q:

周期数据对于细胞收集量有什么要求?

A:

除去碎片之外,建议可供分析的目的细胞在1万以上,虽然细胞数据过大会影响到分析的速度,但不会对细胞各个时期的百分比检测产生影响,拟合效果反而更好,因此在条件允许的情况下,收集量多多益善。

Q:

周期拟合不准确可以自行调整吗?

A:

可以的。且自动拟合之后如不满意结果,也可以通过手动调整的方式,改变G1和G2门的位置,还可以批量应用到其他样本中以保持一致性。

Q:

周期检测可能会受到哪些因素的影响?

A:

首先,不同细胞系的拟合效果存在差异。其次,影响周期拟合效果的因素还有:试剂盒差异、细胞固定方式的影响、收集细胞量的差异、人为操作影响等。因此,为了尽量减少差异,操作标准要规范,最大程度上避免操作误差。

往期回顾
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参考文献

[1]中华人民共和国医药行业标准YY/T 0588-2017,流式细胞仪.国家食品药品监督管理局.2017.

[2]R.B. Struijk,1 C.M. De Winter-Korver,1 S, Simultaneous Purifification of Round and Elongated Spermatids from Testis Tissue Using a FACS-Based DNA Ploidy Assay,International Society for Advancement of Cytometry.





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