应用精要|OMIP-73：14色方案揭秘人类胸腺细胞发育图谱-公司新闻-北京层浪生物科技有限公司

应用精要|OMIP-73：14色方案揭秘人类胸腺细胞发育图谱

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胸腺作为T细胞的"摇篮"，其发育机制直接影响免疫系统的建立。本期应用精要将通过14色流式方案精准解析人类胸腺细胞分化轨迹，为免疫缺陷、自身免疫病研究提供全新视角。

■ 为什么要关注胸腺发育？

胸腺通过独特的微环境调控T细胞从造血干细胞到功能细胞的蜕变过程。尽管小鼠模型研究已较为成熟，但人类早期胸腺发育仍存在诸多空白。近年来，单细胞RNA测序和CD分子表达的研究揭示了胸腺细胞的分子异质性，而建立标准化的细胞分群体系成为关键突破点。

■ 14色方案核心优势：

本研究通过单管14色方案精准的抗体选择和门控策略来了解人类胸腺细胞分类，揭示了T细胞从早期胸腺祖细胞（ETP）到成熟T细胞的完整发育轨迹（图1）。

（图1. T细胞在人类胸腺中的发育轨迹）

试剂方案

试剂方案.png

分析逻辑

胸腺细胞活力分析体系：

■基于磷脂酰丝氨酸暴露原理，采用Annexin V联合膜完整性染料可同步鉴别活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡（Annexin V+/PI-）和晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V+/PI+）。

祖细胞迁移与定向阶段：

■CD34+造血干细胞获得CD45RA+表达进入胸腺，发育成早期胸腺祖细胞（ETP：CD34+CD45RA+CD1a-CD45-）；

■Notch信号激活驱动T系定向分化，CD1a表达标志着T系定向祖细胞（TC）形成，同时抑制向B/NK/DC等分化潜能；

■CD7作为早期T系特征分子持续表达，在TC阶段启动TCRγδ基因座优先重排。

TCR重组与双阳性发育：

■CD7+亚群内启动TCRβ链重排，伴随CD4单阳性细胞（ISP4）形成（CD4+CD34±）；

■功能性TCRβ与前Tα链配对驱动双阳性转化，形成CD4+CD8+CD3-早期双阳性细胞（EDP：CD7+CD34midCD45lowCD3-）；

■TCRα链重排完成时EDP转化为晚期双阳性细胞（LDP：CD4+CD8+CD3+）。

谱系选择机制：

■阳性选择：TCR与胸腺基质MHC分子适度互作决定存活，MHC-I亲和力主导分化为CD8+SP，MHC-II导向CD4+SP；

■阴性选择：通过AIRE介导的自身抗原呈递清除高亲和力克隆；

■发育选择窗口：高强度TCR信号在DP阶段即可诱导Treg分化（CD25+Foxp3+）。

成熟与外迁调控：

■经历选择的单阳性细胞（SP4/SP8/Treg）下调CD69并上调CD45RA；

■成熟T细胞外迁标志：CD3+CD45RA+CD69-表型特征。

结果呈现

胸腺细胞亚群分布特征（Fig1A）：

■门控策略明确区分ETP（CD34+CD45RA+）、TC（CD1a+）、EDP/LDP（CD4+CD8+CD3±）、ISP4（CD4+CD34+）及成熟亚群（SP4/SP8/Treg/Tγδ）；

■比例分析（Fig1C）显示DPs占胸腺细胞75%以上，其中早期双阳性（EDP）数量是晚期双阳性（LDP）的2倍；

■未成熟群体（CD45low）以ISP4 CD34+为主，成熟群体（CD45high）以SP4（>50%）为主导，依次为SP8、Treg和Tγδ细胞。

Figure 1A

分子动态的可视化解析（Fig1D-E）：

■UMAP算法揭示CD45+群体连续分化轨迹：从CD34highCD7low的ETP起始，经CD7+CD1a+的TC阶段，向CD4/CD8双阳性区室演进；

■关键分子共表达模式：CD34与CD45呈现梯度互斥，CD3表达严格限定于LDP及后续成熟阶段，TCR信号相关标记（CD28/CD69）沿发育轴线动态变化。

Figure 1D-E

发育结算验证与定量关系：

■EDP向LDP转化效率（2:1比例）佐证TCRα链重排的生物学瓶颈；

■SP4优势占比（Fig1C）与MHC-II限制性选择的进化保守性相符；

■Treg（~5%）和Tγδ（~3%）的稳定比例反映胸腺微环境对特殊亚群的精准调控。

Figure 1C

知识拓展

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T细胞在人类胸腺中的分化发育

1. ETPs (Early T-cell Precursors)

表型指标：CD34+, CD45-, CD45RA+, CD1a-,CD7+, CD117 (c-Kit)+

特征：早期T细胞前体，具有多能性，尚未完全定向到T细胞谱系。

2. TC (T-lineage-committed cells)

表型指标：CD34+, CD45- ,CD1a+,CD4-,CD8-

特征：已定向到T细胞谱系的细胞。

3. ISP4 CD34+ (CD34-positive immature single-positive CD4 cells)

表型指标：CD34+, CD45- ,CD1a+,CD4+,CD8-

特征：未成熟的单阳性CD4细胞，仍表达CD34。

4. ISP4 CD34- (CD34-negative immature single-positive CD4 cells)

表型指标: CD34-,CD45+, TCRγδ-, CD4+,CD3-,CD8 -

特征：未成熟的单阳性CD4细胞，不表达CD34。

5. EDP CD45low (CD45-low early double-positive cells)

表型指标：CD34+,CD45low, CD1a+ , CD4+, CD8+,

特征：早期双阳性细胞，CD45表达较低。

6. EDP CD45high (CD45-high early double-positive cells)

表型指标：CD34 -, CD45hight, CD4+, CD8+,CD7-

特征：早期双阳性细胞，CD45表达较高。

7. LDP (Late double-positive cells)

表型指标：CD45+, CD4+, CD8+,CD3 + CD7+

特征：晚期双阳性细胞，接近单阳性阶段。

8. SP4 (Single-positive CD4 cells)

表型指标：CD4+, CD3+, CD8-, CD69+, CD45RA-/low

特征：成熟的单阳性CD4细胞。

9. SP8 (Single-positive CD8 cells)

表型指标：CD8, CD3+, CD4-, CD69 (部分表达), CD45RA -/low

特征：成熟的单阳性CD8细胞。

10. rSP4 (Ready-to-egress single-positive CD4 cells)

表型指标：CD4+, CD3+, CD8-,CD69-, CD45RA height, CD1a-

特征：准备离开胸腺的单阳性CD4细胞。

11. rSP8 (Ready-to-egress single-positive CD8 cells)

表型指标：CD8+, CD3 +,CD4-, CD69-, CD45RA height, CD1a-

特征：准备离开胸腺的单阳性CD8细胞。

12. Tγδ (T γδ cells)

表型指标：CD34-,CD45+,TCRγδ+, CD3+/hight， CD4-/low , CD8 -/low

特征：γδT细胞，具有独特的TCRγδ受体。

13. Treg (T regulatory cells)

表型指标：CD4+, CD25 hight, FoxP3+, CD3+, CD45+，CD45RA-

特征：调节性T细胞，具有免疫抑制功能。

14. rTreg (Ready-to-egress T regulatory cells)

表型指标：CD4+, CD25 +, FoxP3+, CD3+, CD69-, CD45RA+/hight

特征：准备离开胸腺的调节性T细胞。

结语：

本研究建立的14色方案为胸腺发育研究提供了标准化工具，其揭示的细胞动态变化机制为免疫疾病诊疗带来新思路。

层浪生物，深耕流式领域十余载，将持续分享更多优秀多色流式解决方案，助力科研新突破！

参考文献：Front Immunol. 2023;14:1123245. DOI:10.3389/fimmu.2023.1123245

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